Drobky světa

Protože jsem nenašel moc textů o Western blotu (v češtině), rozhodl jsem se jeden napsat. Kromě toho, že je to velmi užitečná metoda pro detekci určitého proteinu, je zajímavá i historie názvu "Western blot", protože ten nemá se západem nic společného. Když Edwin Southern vymyslel techniku přenosu kousků DNA na nitrocelulosovou membránu, byla tato technika nazvána "Southern blot" (tedy "Southernovo blotování"). Jakmile se poté vymyslely i analogické postupy s přenosem RNA, resp. proteinů, tak nějakou chytrou (a vtipnou) hlavu napadlo tyto postupy pojmenovat jako slovní hříčku na původní Southern blot - tedy "Nothern blot", resp. "Western blot".

Western blot (WB) je metoda, která umožnuje detekovat určitý protein ve směsi proteinů. WB následuje po gelové elektroforéze (ať už nativní nebo za denaturujících podmínek) namísto obvyklého barvení elektroforegramu. To má jednu výhodu - elektroforéza dělí proteiny podle velikosti, ovšem neříká už nic o tom, zda-li jsou proteiny nějak podobné či nikoliv - pouze zdali mají podobnou hmotnost.

Např. problém: Potřebujeme zjistit, zda-li máme ve vzorku požadovaný protein XXasu o 100 kDa. Pokud budeme barvit gel (ať už stříbrem či nějakým barvivem), můžeme dostat "band" (proužek) na oněch 100 kDa - ovšem nevíme, zda-li je to naše vysněná XXasa anebo nečistota YYasa, která ma shodou okolností taky 100 kDa.
Potřebujeme proto nějakou specifickou reakci, která nám řekne, zda-li máme jít koupit láhev sektu, protože máme ve vzorku XXasu, anebo koupit lano, protože to byla YYasa.

1. Elektroforéza:
Vlastnímu Western blotu předchází elektroforéza, nejčastěji SDS-PAGE (elektroforéza na polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS). Vzorek může obsahovat buď přímo směs proteinů anebo se může jednat o vzorek tkáně či buněčné kultury - v těchto dvou případech musíme "rozmixovat" tyto velké části před tím, než je naneseme na gel (buď homogenizérem, sonifikací či nějak jinak). Tyto vzorky se pak označují jako lyzáty (vznikly lýzou buněk a přitom se uvolnily proteiny). Je dobré přidat do lyzační směsi inhibitory proteas, protože jinak by hrozilo nebezpečí, že lýzou uvolněné proteasy by naši milovatou XXasu rozcupovaly ještě před elektroforézou:-(

Vzorky se poté nanesou na gel, udělá se elektroforéza a po její, skončení jsme připraveni jít na vlastní blot...

2. Blotovaní:
Protože práce s gelem je dosti nepříjemná (asi jako když manipulujete s utuhlým pudinkem), je nutné proteiny přenést (přeblotovat) na membránu - nejčastěji na nitrocelulosovou, popř. na PVDF-membránu. Přístroj ("blotátor") je realizován jako soustavy anoda (spodní díl) a katody (horní díl = víko). Na anodu se položí papír namočený do pufru (vlhkost je nutná, jinak by se gel a membrána spálila díky průchodu el. proudu), na papír membrána, pak gel a nakonec zase namočený papír. Vznikne nám hezký sendvič a po zaklapnutí víkem a spuštění musíme doufat, že záporně nabité proteiny se učinkem el. pole přenesou z gelu na membránu umístěnou pod gelem (přitahuje je kladně nabitá anoda tvořící dno přístroje).

3. Reakce proteinů s protilátkou:
Po přenosu proteinů na membránu můžeme pracovat dále - nejdříve se membrána nechá inkubovat s něčím, co blokuje nespecifické navázaní protilátky na membránu.
Např. při použití BSA obsadí molekuly BSA všechna místa na membráně, kam se nepřenesly proteiny při přenosu a kam by se potenciálně mohla vázat primární protilátka nespecifickou interakcí s membránou.
Poté se přidá primární protilátka, tj. protilátka proti našemu proteinu, která s našim proteinem specificky interaguje. Opět necháme spolu inkubovat.
Po promytí se přidá sekundární protilátka, tj. protilátka proti oné primární protilátce. tato sekundární protilátka je nějakým způsobem značena, např. je spojena s křenovou peroxidasou (HRP = horseradish peroxidase), která poté katalyzuje určitou enzymatickou reakci.

4. Vyvolání blotu:
Spočívá v tom, že ona křenová peroxidasa je použita ve spojení s chemiluminiscenční látkou - produkt reakce (katalýza peroxidasou) vykazuje luminiscenci, která může být detekována použítím fotografického papíru anebo speciální CCD kamery

5. Výsledek:
Lumiscence vychází z míst, kde se uskutečňuje přeměna chemiluminiscenčního činidla. Ta je katalyzována peroxidasou, která je spojena se sekundární látkou, která je navázaná na primární protilátku, která se specificky navázala na náš hledaný protein. Tedy v místě, kde je luminiscence, je i náš protein:-)

Klady a zápory:
+ poměrně jednoznačná identifikace proteinu ve směsi
- nutnost mít primární protilátku, jinak je WB neuskutečnitelný